相衬显微镜原理与应用
引言：活细胞为什么在显微镜下”看不见”
培养皿里正在分裂的细胞，用普通明场显微镜看，几乎是一片均匀的亮场——细胞轮廓若有若无，细节完全无法辨认。要让细胞”现形”，传统做法是固定、染色，但染色剂本身有毒性，细胞在观察前就已经死亡，活体动态根本看不到。
相衬显微镜（phase contrast microscopy）就是为这个问题发明的。荷兰物理学家 Frits Zernike 在 20 世纪 30 年代初提出把透明样本的”相位变化”转成可见的”亮度变化”的方法（Nikon 资料记载为 1934 年首次描述），1953 年因此获得诺贝尔物理学奖 [S1][S4]。它不需要染色，就能直接观察活细胞、微生物等透明样本，至今仍是生物实验室里最常用的无标记观察手段之一 [S5]。
这篇文章要回答的核心问题是：透明样本明明”有结构”，为什么明场下看不见？相衬显微镜又是如何把这种”看不见的结构”变成图像的？
透明样本为什么看不见：信息藏在相位里
先看一个基本事实：光在折射率为 n 的介质中走过厚度 t，光程（OPL）为 n·t。细胞等透明样本对可见光几乎不吸收，只改变透射光的相位——样本与周围介质的折射率差 Δn 和样本厚度 t 共同造成光程差：
$$\mathrm{OPD} = \Delta n \cdot t$$
对应的相位差为：
$$\delta = \frac{2\pi}{\lambda} \Delta n \cdot t$$
典型量级是多少？以培养皿中的单层细胞为例：细胞厚度约 5 µm，折射率约 1.36；培养基折射率约 1.335。两者造成的光程差约 0.125 µm，大约是绿光的四分之一波长 [S1]。
人眼和普通探测器只能感知光的强度（振幅的平方），对相位不敏感。明场下，透射光经过透明样本后波前发生了弯曲（相位被调制），但振幅几乎不变，因此像面强度几乎处处相同——细胞就”消失”在背景里了。相衬显微镜做的，就是把这份相位差转成强度差，让细胞以明暗对比的形式显形。图 1 用同一批洋葱根尖细胞直观展示了这种差别：左图为相衬模式，细胞壁、核仁等结构清晰可辨；右图为明场模式，同样区域几乎看不出细胞结构。
图 1：洋葱根尖细胞在相衬（左）与明场（右）下的对比，100× ph3 油浸物镜。来源：Wikimedia Commons（Catfaster，CC BY-SA 4.0）。
核心原理：在物镜后焦面把两束光”分开处理”
Zernike 相衬的巧妙之处，是把一束光在概念上分成两部分来处理。
入射光透过相位对象时，可以分解为两部分 [S1]：
- 0 级光（surround，S）：未被样本衍射的背景光，沿原方向传播；
- 衍射光（diffracted，D）：被样本细节衍射、偏折的光，携带着样本结构的信息。
样本的折射率结构使衍射光相对 0 级光延迟约 λ/4。明场下，0 级光和衍射光在像面重新合成，合成的像波振幅与背景几乎相同（两者之间的有效相位差只有约 λ/20 量级），所以强度几乎不变、看不见细胞 [S1]。
Zernike 的思路是：在物镜后焦面（衍射面）把 0 级光和衍射光分开，对 0 级光单独”动手脚”——用相位环（phase plate）衰减它，并给它施加 ±λ/4 的相位改变，然后再让两束光在像面干涉。这样一来，原来微小的相位差被放大成接近半波的相位差，干涉结果产生强烈的强度对比 [S1][S2]。
实现这套方案的关键，是让光路上的每个元件各司其职。先认识整条光路上的元件（图 2 是这套光路的整体示意），再逐段看光是怎么走的。
光路上的元件：各自负责什么
一台相衬显微镜的光路元件，按图 2 示意中光的传播方向（图中光从上方进入）依次是：光源 → 环形光阑 → 聚光镜 → 样本 → 物镜 → 像面。真实直立式显微镜的光源在仪器底部、光从下往上走，元件顺序完全相同——示意图把光画成从上往下，只是为了和光路图对照阅读方便。表 1 把每个元件的位置和作用列清楚。
表 1：相衬显微镜光路上的元件、位置与作用 [S1][S2]。
| 元件 | 位置 | 作用 |
|---|---|---|
| 光源 | 光路上端（图 2 中光从上方进入；真实显微镜中在底部） | 提供照明光 |
| 环形光阑（annulus） | 聚光镜前焦面（光源一侧，光先经过它） | 中心挡光，形成空心锥照明 |
| 聚光镜（condenser） | 环形光阑与样本之间 | 把穿过环形光阑的光整理成空心锥照明投向样本 |
| 样本（specimen） | 载物台上，聚光镜与物镜之间 | 相位对象：调制透射光相位并产生衍射 |
| 物镜（objective） | 样本与像面之间（图中在样本下方） | 收集 0 级光与衍射光并成像；后焦面是频谱面 |
| 相位环（phase plate） | 物镜后焦面 | 衰减 0 级光并施加 ±λ/4 相位改变 |
| 像面（image plane） | 物镜后方（目镜或相机） | 0 级光与衍射光重新干涉，形成明暗图像 |
图 2：相衬显微镜工作原理示意——环形光阑形成空心锥照明，0 级光（S）经物镜后焦面的相位环被衰减并移相，衍射光（D）绕过相位环，两束光在像面干涉形成对比。来源：Wikimedia Commons（Egelberg，CC BY-SA 3.0）。
光路逐段拆解：从光源到像面
把上面的元件串起来，光是这样一步步走的：
- 光源与环形光阑：光源在光路上端（图 2 中光从上方进入；真实直立式显微镜中光源在仪器底部、光从下往上走，元件顺序相同）。光离开光源后，先经过环形光阑（annulus）——一块中心挡光、只有一圈透明圆环的挡板，它位于聚光镜前焦面（光源一侧）[S1][S2]。
- 聚光镜把照明变成”空心锥”：穿过环形光阑的光接着进入聚光镜（condenser）。聚光镜把环形光阑发出的光整理成”空心锥”照明：环形光阑上每一点的光经过聚光镜后变成一束固定角度的平行光，整个圆环就形成一圈以固定锥角照向样本的光——中心没有直射光，样本被一圈斜向光包围着照 [S1][S2]。
- 样本放在哪里：样本（specimen）放在载物台上，位于聚光镜与物镜之间，正好处于物镜的焦面（工作距离内）。观察时把培养皿或载玻片放在这个位置，光从聚光镜一侧穿过样本 [S1]。
- 样本做了什么——衍射光从哪里来：样本内部折射率 × 厚度（n·t）在空间上不均匀，相当于一个”相位光栅”。平面波穿过它时，波前被局部推迟，出射光不再只有一个方向：大部分光保持原方向传播（0 级光 S），一部分被偏折到其他角度（衍射光 D）。偏折角度由结构的空间周期决定——细节越细（周期 Λ 越小），偏折越大，一阶衍射角近似满足 $\sin\theta \approx \lambda / \Lambda$ [S10]。换句话说，样本里不同尺度的结构把光”掰”到了不同的角度。
- 物镜与后焦面：角度被换算成位置：物镜（objective）收集所有出射光并向像面成像。物镜内部有一个特殊平面——后焦面（back focal plane）：以同一角度出射的平行光会聚到后焦面上的同一点。于是，0 级光（保持空心锥的固定锥角）在后焦面上会聚成一个圆环；被样本偏折的衍射光（角度各不相同）会聚在圆环的内外不同位置。后焦面因此是”频谱面”——样本空间结构的信息在这里按角度摊开。
- 相位环：只对 0 级光动手脚：物镜后焦面上镀着相位环（phase plate），位置正好与 0 级光会聚成的那个圆环共轭重合。它镀有部分吸收的金属膜，把 0 级光衰减，并施加 ±λ/4 的相位改变 [S1][S2]。衍射光分布在圆环内外的大部分区域，从相位环之外通过、几乎不受影响（理想模型；实际少量衍射光也会穿过相位环并被同样处理，这正是晕圈伪影的来源之一，见”局限”一节）。
- 像面：两束光重新合成图像：处理过的 0 级光与未受影响的衍射光继续传播到像面（目镜或相机传感器），在此重新合成样本的像。因为 0 级光被衰减并移相，两束光干涉产生明暗对比——透明的相位对象终于”现形”了。
为什么是 λ/4？因为样本已经给衍射光造成了约 λ/4 的延迟。如果相位环再把 0 级光提前 λ/4，两者叠加就变成约半波（λ/2）的相位差——相消干涉；如果相位环把 0 级光延迟 λ/4，正好抵消样本的延迟——相长干涉。这两种选择对应两种成像模式：
- 正相衬（positive，最常用）：相位环把 0 级光提前 λ/4，叠加样本造成的 λ/4 延迟后，0 级光与衍射光相位差约 π，发生相消干涉，光学上更致密的样品比背景暗 [S2][S3]；
- 负相衬（negative）：相位环把 0 级光延迟 λ/4，与样本造成的 λ/4 延迟相抵消，0 级光与衍射光几乎同相，发生相长干涉，样品比背景亮，效果接近暗场 [S2][S3]。
用强度写出来更直观。设经过相位环衰减后的 0 级光振幅为 a、衍射光振幅为 b（背景处只有 0 级光，强度 $I_0 \propto a^2$）。正相衬下两束光相位差接近 π，样品处合成强度 $I \propto (a-b)^2 < I_0$，样品变暗；负相衬下相位差接近 0，$I \propto (a+b)^2 > I_0$，样品变亮。实际中通常 $a \gg b$，对比来自交叉项——这正是相位信息被”翻译”成强度的过程。
需要说明的是：上述描述是相衬原理的理想化模型。实际图像强度与光程差并不是严格的线性关系，还存在晕圈、shade-off 等伪影（见下文”局限”一节）。
硬件与操作：光阑、物镜与匹配规则
相衬成像对配套精度要求很高，实际操作有两条硬规则 [S2]：
- 光阑与物镜必须匹配：不同放大倍率的物镜需要不同直径的环形光阑。以 Nikon 体系为例，Ph1 配 10×/20× 物镜，Ph2 配 40×/60× 物镜，Ph3 配 100× 物镜。安装后要用相位望远镜（phase telescope）目视对准，让环形光阑的像与物镜相位环完全重合。
- 不同厂商一般不能混用：相衬物镜与聚光镜的相位环、光阑是成套设计的，跨厂商混用会导致对比度差甚至无法成像。
相衬物镜本身也有细分（表 2），命名规则反映了对比度和用途取向 [S2]。相衬物镜通常在镜筒上用绿色字样标识。
表 2：Nikon 常见相衬物镜型号与用途。命名规则以厂商资料为准 [S2]。
| 型号 | 含义 | 对比度取向 | 典型用途 |
|---|---|---|---|
| DL | 暗低（dark low） | 中低 | 通用，活细胞培养观察 |
| DLL | 暗低低对比（dark low low） | 低 | 多模式通用 |
| ADL | 消晕圈（apodized dark low） | 中 | 大结构，减弱边缘亮晕 |
| DM | 暗中（dark medium） | 高 | 细纤维、鞭毛等小结构 |
| BM | 亮中（bright medium，负相衬） | 中 | 鞭毛、纤维蛋白、血细胞计数 |
应用：不染色看活体
相衬显微镜最大的价值，是不需要杀死、固定、染色就能观察活体样本的动态过程 [S1][S4]。图 3 是相衬显微镜拍摄的活体培养细胞（HaCaT 人角质形成细胞系，10×/0.25 Ph1 物镜）：细胞轮廓、核周结构与贴壁形态都清晰可辨，而这些细节在明场下几乎看不到。典型的应用对象包括 [S1][S5]：
图 3：HaCaT 细胞（人永生化角质形成细胞系）的相衬显微图（Nikon Eclipse Ts2 倒置显微镜，10×/0.25 Ph1 物镜，100× 总放大）。来源：Wikimedia Commons（Accuratelibrarian，CC BY-SA 4.0）。
- 活细胞培养：观察细胞形态、分裂、运动、迁移；
- 微生物：细菌、酵母、原生动物；
- 薄组织切片和亚细胞结构：细胞核、线粒体等细胞器；
- 工业与材料样本：光刻图案的透明层、纤维、乳胶分散液、玻璃碎片等。
历史上，二战期间德国耶拿的蔡司（Zeiss）工厂最先量产实用相衬显微镜，对生物学研究产生了深远影响 [S1]。
如今相衬很少”单打独斗”：现代显微镜的相衬物镜常与 DIC、荧光、偏光等模式组合在同一台设备上，按样本需求切换使用 [S2]。表 3 对比了几种常见的无标记显微术。
表 3：几种无标记显微术的对比。基于 Nikon MicroscopyU 教程（S1、S2）、Nikon 术语表（S8）与 QPI 综述（S6、S7）中的描述；明场对透明样本几乎无对比，相衬与 DIC 均为定性对比技术。
| 模式 | 对比机制 | 定量能力 | 特点 |
|---|---|---|---|
| 明场 | 样本吸收 | 否 | 透明样本几乎不可见 |
| 相衬 | 0 级光移相后与衍射光干涉 | 定性为主 | 无需染色，活细胞标准手段；大结构有晕圈 |
| DIC | 一对横向分开的偏振光束的光程差干涉 | 定性为主 | 对厚样本更友好，对离焦特征不敏感 |
| QPI | 直接测量相位延迟（折射率×厚度） | 是 | 无标记定量，可测细胞干质量等 |
局限：晕圈、shade-off 与”非定量”
相衬图像不能当作”所见即所得”的定量数据，主要有三个局限 [S1][S2]：
- 晕圈（halo）：正相衬下，大结构（细胞核、整细胞、纤维）边缘会出现一圈亮晕，这是相位环对未衍射光的衰减和周边衍射光泄漏共同造成的，会影响形态判断和定量。消晕圈（apodized）相位环通过附加一个中性密度环来减弱该效应（表 2 中的 ADL 物镜）。
- shade-off：大片均匀的样品内部会出现强度渐变伪影，样品边缘与中心亮度不一致。
- 非定量：相衬图像的强度与光程差并非线性关系，传统相衬只能提供定性对比，不能直接读出折射率或厚度。
现代发展：从定性对比到定量相位成像
传统相衬的”非定量”痛点，由定量相位成像（QPI，quantitative phase imaging）补齐。QPI 直接测量样本引起的相位延迟（折射率 × 厚度），实现无标记、定量的分析，已应用于细胞干质量测量、血液学、微生物学、传染病研究等领域 [S6]；结合机器学习和深度学习，还能进一步增强数据解读能力 [S7]。如果说 Zernike 相衬是”把相位变成可见的明暗”，QPI 就是”把相位变成可测量的数字”——两者一脉相承，后者是前者在定量方向上的自然延伸。
与平台历史文章的对照
平台在 2026-08-08 发布过《非局部超表面：偏振切换的相衬与明场双模式成像》（S9），介绍用一片超表面在偏振切换下实现明场与相衬双模式。那篇是”新型器件”方案：用空间滤波（OTF 工程）直接对图像做一阶导数运算，把相位梯度转成强度；本文讲的则是经典 Zernike 方案：用”环形光阑 + 物镜相位环”分离 0 级光与衍射光并让它们干涉。两者目标相同——让透明样本显形——但一个是经典的显微镜光学设计，一个是近年来逆向设计超表面的新思路。对照阅读，正好能看出”同一个物理目标，可以有多少种实现路径”。
参考资料
- [S1] Nikon MicroscopyU：”Introduction to Phase Contrast Microscopy.” MicroscopyU
- [S2] Nikon MicroscopyU：”Phase Contrast Microscope Configuration.” MicroscopyU
- [S3] Nikon 术语表：”Positive / Negative Phase Contrast Microscopy.” Nikon
- [S4] The Nobel Prize：”Frits Zernike – Facts.” Nobel Prize
- [S5] Wikipedia：”Phase-contrast microscopy.” Wikipedia
- [S6] Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. “Quantitative phase imaging in biomedicine.” Nature Photonics 12, 578–589 (2018). Nature Photonics
- [S7] Javidi, B. et al. “Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review.” arXiv:1806.03982. arXiv
- [S8] Nikon 术语表：”Differential Interference Contrast（DIC）.” Nikon
- [S9] 时间帧平台文章：”非局部超表面：偏振切换的相衬与明场双模式成像.” time-frame.cloud
- [S10] Wikipedia：”Diffraction grating.” Wikipedia